Desktop Gigapixel-microscoop: 10 stappen (met afbeeldingen)

2024 Auteur: John Day | [email protected]. Laatst gewijzigd: 2024-01-30 11:17

In optische microscopen is er een fundamentele wisselwerking tussen gezichtsveld en resolutie: hoe fijner het detail, hoe kleiner het gebied dat door de microscoop wordt afgebeeld. Een manier om deze beperking te overwinnen is om het monster te vertalen en beelden over een groter gezichtsveld te verwerven. Het basisidee is om veel afbeeldingen met een hoge resolutie aan elkaar te naaien om een groot gezichtsveld te vormen. In deze afbeeldingen krijgt u zowel het volledige monster als fijne details in elk deel van het monster te zien. Het resultaat is een beeld dat bestaat uit ongeveer een miljard pixels, veel groter in vergelijking met de foto's gemaakt door een dSLR of smartphone, die doorgaans ongeveer 10 tot 50 miljoen pixels hebben. Bekijk deze gigapixel-landschappen voor een indrukwekkende demonstratie van de enorme hoeveelheid informatie in deze afbeeldingen.

In deze instructable zal ik ingaan op het bouwen van een microscoop die in staat is een gezichtsveld van 90 mm x 60 mm af te beelden met pixels die overeenkomen met 2 m bij het monster (hoewel ik denk dat de resolutie waarschijnlijk dichter bij 15 m ligt). Het systeem maakt gebruik van cameralenzen, maar hetzelfde concept kan worden toegepast met microscoopobjectieven om een nog fijnere resolutie te krijgen.

Ik heb de gigapixel-afbeeldingen die ik met de microscoop heb verkregen, geüpload naar EasyZoom:

Afbeelding National Geographic-tijdschrift uit 1970

Gehaakt tafelkleed dat mijn vrouw heeft gemaakt

Diverse elektronica

Andere bronnen:

Optische microscopie tutorials:

Optische resolutie:

Naast het samenvoegen van afbeeldingen, maakt de recente vooruitgang in computationele beeldvorming gigapixelmicroscopie mogelijk zonder het monster zelfs maar te verplaatsen!

Stap 1: Bevoorradingslijst

Materialen:

1. Nikon dSLR (ik gebruikte mijn Nikon D5000)

2. 28 mm brandpuntsafstandlens met 52 mm schroefdraad

3. 80 mm brandpuntsafstandlens met 58 mm schroefdraad

4. 52 mm tot 58 mm omgekeerde koppeling

5. Statief

6. Zeven vellen triplex van 3 mm dik

7. Arduino Nano

8. Twee H-bridge L9110

9. Twee IR-zenders

10. Twee IR-ontvangers

11. Drukknop

12. Twee 2.2kOhm-weerstanden

13. Twee weerstanden van 150 Ohm

14. Een weerstand van 1kOhm

15. Afstandsbediening voor Nikon-camera

16. Zwart aanplakbord

17. Hardwarekit:

18. Twee stappenmotoren (ik gebruikte Nema 17 Bipolaire stappenmotor 3.5V 1A)

19. Twee 2 mm draadspindels

20. Vier kussenblokken

21. Twee spindelmoeren

22. Twee lagerglijbussen en lineaire assen van 200 mm:

23. 5V voeding:

24. Draadomslagdraad

Gereedschap:

1. Lasersnijder

2. 3D-printer

3. Inbussleutels

4. Draadknippers

5. Draadwikkelgereedschap

Stap 2: Systeemoverzicht

Om het monster te vertalen, verplaatsen twee in orthogonale richtingen uitgelijnde stappenmotoren een podium in de x- en y-richting. De motoren worden aangestuurd met twee H-bruggen en een Arduino. Een IR-sensor aan de basis van de stappenmotor wordt gebruikt om de trappen op nul te zetten, zodat ze niet tegen een van de uiteinden van de blokken aanlopen. Een digitale microscoop is boven de XY-tafel geplaatst.

Zodra het monster is gepositioneerd en het podium is gecentreerd, drukt u op een knop om de acquisitie te starten. De motoren verplaatsen het podium naar de linkerbenedenhoek en de camera wordt geactiveerd. De motoren vertalen het monster vervolgens in kleine stappen, terwijl de camera op elke positie een foto maakt.

Nadat alle afbeeldingen zijn gemaakt, worden de afbeeldingen aan elkaar genaaid om een gigapixelafbeelding te vormen.

Stap 3: Microscoopmontage

Ik heb een microscoop met lage vergroting gemaakt met een dSLR (Nikon 5000), een Nikon 28mm f/2.8 lens en een Nikon 28-80mm zoomlens. De zoomlens was ingesteld op een brandpuntsafstand gelijk aan 80 mm. De set van de twee lenzen werkt als een microscoopbuislens en objectieflens. De totale vergroting is de verhouding van de brandpuntsafstanden, ongeveer 3X. Deze lenzen zijn echt niet ontworpen voor deze configuratie, dus om het licht als een microscoop te laten voortplanten, moet je een diafragmastop tussen de twee lenzen plaatsen.

Monteer eerst de lens met langere brandpuntsafstand op de camera. Knip een cirkel uit een zwart posterboard met een diameter die ongeveer even groot is als de voorkant van de lens. Snijd vervolgens een kleine cirkel in het midden (ik koos voor ongeveer 3 mm diameter). De grootte van de cirkel bepaalt de hoeveelheid licht die het systeem binnenkomt, ook wel de numerieke apertuur (NA) genoemd. De NA bepaalt de laterale resolutie van het systeem voor goed ontworpen microscopen. Dus waarom geen hoge NA gebruiken voor deze opstelling? Welnu, er zijn twee belangrijke redenen. Ten eerste, als de NA toeneemt, worden de optische aberraties van het systeem prominenter en wordt de resolutie van het systeem beperkt. In een onconventionele opstelling als deze zal dit waarschijnlijk het geval zijn, dus het verhogen van de NA zal uiteindelijk niet langer helpen om de resolutie te verbeteren. Ten tweede is de scherptediepte ook afhankelijk van NA. Hoe hoger de NA, hoe kleiner de scherptediepte. Dit maakt het moeilijk om objecten die niet plat zijn allemaal scherp te krijgen. Als de NA te hoog wordt, bent u beperkt tot het afbeelden van microscoopglaasjes, die dunne monsters hebben.

De positionering van de diafragma-stop tussen de twee lenzen maakt het systeem ongeveer telecentrisch. Dat betekent dat de vergroting van het systeem onafhankelijk is van de objectafstand. Dit wordt belangrijk voor het aan elkaar naaien van afbeeldingen. Als het object een variërende diepte heeft, zal het zicht vanuit twee verschillende posities van perspectief zijn verschoven (zoals het menselijk zicht). Het samenvoegen van afbeeldingen die niet afkomstig zijn van een telecentrisch beeldvormingssysteem is een uitdaging, vooral met zo'n hoge vergroting.

Gebruik de 58 mm naar 52 mm lens reverse coupler om de 28 mm lens aan de 80 mm lens te bevestigen met het diafragma in het midden.

Stap 4: XY-podiumontwerp

Ik heb het podium ontworpen met Fusion 360. Voor elke scanrichting zijn er vier onderdelen die 3D moeten worden geprint: mountermontage, twee schuifeenheidverlengers en een spindelmontage. De basis en platforms van het XY-podium zijn lasergesneden uit 3 mm dik multiplex. De basis bevat de X-richting motor en schuifregelaars, het X-platform bevat de Y-richting motor en schuifregelaars en het Y-platform houdt het monster vast. De basis bestaat uit 3 bladen en de twee platforms bestaan uit 2 bladen. De bestanden voor lasersnijden en 3D-printen worden in deze stap geleverd. Na het knippen en printen van deze onderdelen ben je klaar voor de volgende stappen.

Stap 5: Montage motormontage

Wikkel de draad met behulp van een draadwikkelgereedschap om de draden van twee IR-zenders en twee IR-ontvangers. Kleur de draden in een kleurcode zodat u weet welk uiteinde dat is. Knip vervolgens de draden van de diodes af, zodat alleen de draadwikkeldraden vanaf dat moment lopen. Schuif de draden door de geleiders in de motorsteun en druk vervolgens de diodes op hun plaats. De draden zijn zo gericht dat ze niet zichtbaar zijn totdat ze de achterkant van het apparaat verlaten. Deze draden kunnen worden verbonden met de motordraden. Monteer nu de stappenmotor met behulp van vier M3-bouten. Herhaal deze stap voor de tweede motor.

Stap 6: Stage Montage

Lijm de uitsnijdingen van Base 1 en Base 2 aan elkaar, waarvan één met zeshoekige openingen voor de M3-moeren. Nadat de lijm is opgedroogd, hamert u de M3-moeren op hun plaats. De moeren draaien niet als ze in het bord worden gedrukt, dus je kunt de bouten later indraaien. Lijm nu het derde basisvel (Basis 3) om de moeren te bedekken.

Nu is het tijd om de lead-nut mount te monteren. Verwijder eventuele extra gloeidraad uit de houder en druk vervolgens vier M3-moeren op hun plaats. Ze passen goed, dus zorg ervoor dat je de bout- en moerruimte vrijmaakt met een kleine schroevendraaier. Zodra de moeren zijn uitgelijnd, duwt u de draadmoer in de houder en bevestigt u deze met 4 M3-bouten.

Bevestig de kussenblokken, schuifbevestigingen en motorbevestiging voor de lineaire vertaler in X-richting op de basis. Plaats de geleidemoer op de geleideschroef en schuif de geleideschroef op zijn plaats. Gebruik de koppeling om de motor op de spindel aan te sluiten. Plaats de schuifeenheden in de staven en duw de staven vervolgens in de schuifbevestigingen. Bevestig tot slot de schuifbevestigingsverlengstukken met M3-bouten.

De multiplexplaten X1 en X2 worden op dezelfde manier als de basis aan elkaar gelijmd. Dezelfde procedure wordt herhaald voor de lineaire vertaler in Y-richting en de monstertafel.

Stap 7: Scannerelektronica

Elke stappenmotor heeft vier kabels die zijn aangesloten op een H-brugmodule. De vier kabels van de IR-zender en -ontvanger zijn aangesloten op de weerstanden volgens het bovenstaande schema. De uitgangen van de ontvangers worden aangesloten op analoge ingang A0 en A1. De twee H-bridge modules zijn aangesloten op pin 4-11 op de Arduino Nano. Een drukknop is aangesloten op pin 2 met een weerstand van 1kOhm voor eenvoudige gebruikersinvoer.

Ten slotte is de triggerknop voor de dSLR verbonden met een externe sluiter, zoals ik deed voor mijn CT-scanner (zie stap 7). Knip de kabel van de afstandsbediening door. De draden zijn als volgt gelabeld:

Geel – focus

Rood – sluiter

Wit – grond

Om de opname scherp te stellen, moet de gele draad worden aangesloten op aarde. Om een foto te maken, moeten zowel de gele als de rode draad met aarde worden verbonden. Ik heb een diode en de rode kabel aangesloten op pin 12, en vervolgens heb ik een andere diode en de gele kabel op pin 13 aangesloten. De setup is zoals beschreven in DIY Hacks en How-Tos instructable.

Stap 8: Gigapixel-afbeeldingen verkrijgen

Bijgevoegd is de code voor de gigapixelmicroscoop. Ik gebruikte de Stepper-bibliotheek voor het aansturen van de motoren met de H-brug. Aan het begin van de code moet u het gezichtsveld van de microscoop specificeren en het aantal afbeeldingen dat u in elke richting wilt verkrijgen.

De microscoop die ik maakte had bijvoorbeeld een gezichtsveld van ongeveer 8,2 mm x 5,5 mm. Daarom heb ik de motoren gericht om 8 mm in de x-richting en 5 mm in de y-richting te verschuiven. Er worden 11 afbeeldingen in elke richting verkregen, in totaal 121 afbeeldingen voor het volledige gigapixelbeeld (meer details hierover in stap 11). De code berekent vervolgens het aantal stappen dat de motoren moeten maken om de fase met dit aantal te vertalen.

Hoe weten de trappen waar ze zijn ten opzichte van de motor? Hoe vertalen de fasen zich zonder een van beide uiteinden te raken? In de setup-code heb ik een functie geschreven die het podium in elke richting beweegt totdat het het pad tussen de IR-zender en IR-ontvanger verbreekt. Wanneer het signaal op de IR-ontvanger onder een bepaalde drempel zakt, stopt de motor. De code volgt dan de positie van het podium ten opzichte van deze startpositie. De code is zo geschreven dat de motor niet te ver vertaalt, waardoor het podium in het andere uiteinde van de spindel zou lopen.

Zodra het podium in elke richting is gekalibreerd, wordt het podium naar het midden vertaald. Met behulp van een statief plaatste ik mijn dSLR-microscoop boven het podium. Het is belangrijk om het cameraveld uit te lijnen met de gekruiste lijnen op het monsterpodium. Zodra het podium is uitgelijnd met de camera, heb ik het podium afgeplakt met wat schilderstape en vervolgens het monster op het podium geplaatst. De focus werd aangepast met de z-richting van het statief. De gebruiker drukt vervolgens op de drukknop om de acquisitie te starten. Het podium vertaalt zich naar de linkerbenedenhoek en de camera wordt geactiveerd. Het podium scant vervolgens het monster, terwijl de camera op elke positie een foto maakt.

Er is ook een code bijgevoegd voor het oplossen van problemen met de motoren en IR-sensoren.

Stap 9: Afbeeldingen samenvoegen

Met alle verkregen afbeeldingen staat u nu voor de uitdaging om ze allemaal aan elkaar te naaien. Een manier om afbeeldingen samen te voegen is door alle afbeeldingen handmatig uit te lijnen in een grafisch programma (ik gebruikte Autodesk's Graphic). Dit zal zeker werken, maar het kan een pijnlijk proces zijn en de randen van de afbeeldingen zijn merkbaar in de gigapixelafbeeldingen.

Een andere optie is om beeldverwerkingstechnieken te gebruiken om de afbeeldingen automatisch aan elkaar te hechten. Het idee is om vergelijkbare kenmerken te vinden in het overlappende gedeelte van aangrenzende afbeeldingen en vervolgens een translatietransformatie op de afbeelding toe te passen, zodat de afbeeldingen met elkaar worden uitgelijnd. Ten slotte kunnen de randen worden samengevoegd door de overlappende sectie te vermenigvuldigen met een lineaire gewichtsfactor en ze bij elkaar op te tellen. Dit kan een ontmoedigend algoritme zijn om te schrijven als beeldverwerking nieuw voor u is. Ik heb een tijdje aan het probleem gewerkt, maar ik kon geen volledig betrouwbaar resultaat krijgen. Het algoritme worstelde het meest met voorbeelden die overal zeer vergelijkbare kenmerken hadden, zoals de stippen in de afbeelding van het tijdschrift. Bijgevoegd is de code die ik in Matlab heb geschreven, maar het heeft wat werk nodig.

De laatste optie is om gigapixel fotografie stitching-programma's te gebruiken. Ik heb geen suggesties, maar ik weet dat ze er zijn.

Stap 10: Microscoopprestaties

Voor het geval je het gemist hebt, hier zijn de resultaten: tijdschriftafbeelding, gehaakt tafelkleed en diverse elektronica.

De specificaties van het systeem staan in de bovenstaande tabel. Ik probeerde beeldvorming met zowel een 28 mm als een 50 mm lens met brandpuntsafstand. Ik schatte de best mogelijke resolutie van het systeem op basis van de diffractielimiet (ongeveer 6 m). Het is eigenlijk moeilijk om dit experimenteel te testen zonder een doel met hoge resolutie. Ik heb geprobeerd een vectorbestand af te drukken dat op dit grootformaat fotografieforum wordt vermeld, maar ik werd beperkt door mijn printerresolutie. Het beste dat ik met deze afdruk kon vaststellen, was dat het systeem een resolutie van <40 m had. Ik zocht ook naar kleine, geïsoleerde kenmerken op de monsters. Het kleinste kenmerk in de afdruk van het tijdschrift is de inktvlek, die ik ook op ongeveer 40 m schat, dus ik kon het niet gebruiken om een betere schatting van de resolutie te krijgen. Er waren kleine kuiltjes in de elektronica die vrij goed geïsoleerd waren. Omdat ik het gezichtsveld kende, kon ik het aantal pixels tellen dat de kleine divot in beslag nam om een schatting van de resolutie te krijgen, ongeveer 10-15 μm.

Over het algemeen was ik blij met de prestaties van het systeem, maar ik heb een paar opmerkingen voor het geval je dit project wilt uitproberen.

Stabiliteit van het podium: Zorg ten eerste voor lineaire podiumcomponenten van hoge kwaliteit. De componenten die ik gebruikte hadden veel meer speling dan ik dacht. Ik heb voor elke hengel maar één van de slider mounts in de kit gebruikt, dus misschien voelde de stage daarom niet erg stabiel aan. Het podium werkte goed genoeg voor mij, maar dit zou meer een probleem worden voor systemen met een hogere vergroting.

Optica voor hogere resolutie: Hetzelfde idee kan worden gebruikt voor microscopen met een hogere vergroting. Er zijn echter kleinere motoren met een fijnere stapgrootte vereist. Een vergroting van 20x met deze dSLR zou bijvoorbeeld resulteren in een gezichtsveld van 1 mm (als de microscoop zo'n groot systeem kan afbeelden zonder vignettering). Electronupdate gebruikte stappenmotoren van een cd-speler in een mooie uitvoering voor een microscoop met een hogere vergroting. Een andere afweging is een geringe scherptediepte, wat betekent dat de beeldvorming beperkt zal zijn tot dunne monsters en dat je een fijner translatiemechanisme in de z-richting nodig hebt.

Stabiliteit van het statief: Dit systeem zou beter werken met een stabielere camerabevestiging. Het lenssysteem is zwaar en het statief is 90 graden gekanteld ten opzichte van de positie waarvoor het is ontworpen. Ik moest de voeten van het statief vastplakken om de stabiliteit te helpen. De sluiter kan de camera ook voldoende schudden om de beelden onscherp te maken.